病例与方法
1．病例：4例患者均于2011年11月至2013年3月期间在北京大学血液病研究所进行allo-HSCT且移植后复发、经化疗联合改良DLI效果不佳。患者主要临床特征见表1。
表1. 4例异基因造血干细胞移植后复发急性髓系白血病患者一般资料及地西他滨治疗前情况.
例号
年龄（岁）
性别
移植前疾病状态
染色体核型
供者
HLA位点不合数
急性GVHD
慢性GVHD
地西他滨前植活状态
1
14
女
复发，ETO 3.4%，C-KIT突变（+）
正常
兄供妹
3
Ⅱ度
中度
完全供者型
2
42
男
CR1
良好，t(8;22)
弟供兄
0
无
中度
完全供者型
3
41
女
复发，NPM1 14.32%，FLT3-ITD（+）
正常
兄供妹
0
无
无
移植后1个月完全供者型，地西他滨治疗前未查
4
48
男
复发，WT1 61.1%
正常
非血缘
1
Ⅰ度
轻度
完全供者型
例号
年龄（岁）
性别
移植后MRD阳性时间
移植后血液学复发时间
地西他滨前治疗
IL-2
改良DLI
干扰素
化疗
1
14
女
1个月ETO 5.0%，2个月ETO 3.6%
无
2个疗程
移植后55 d预防性
无
HAA
2
42
男
移植后3个月
移植后6个月
2个疗程
移植后8个月治疗性
2个月
IA
3
41
女
移植后1.5个月
移植后1.5个月
无
移植后1个月预防性
无
无
4
48
男
移植后2个月WT1 4.3%，2.5个月WT1 11.1%，FCM（+）
无
无
移植后1.5个月预防性
无
无
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注：GVHD：移植物抗宿主病；MRD：微小残留病；CR1：第一次完全缓解；FCM：流式细胞术；DLI：供者淋巴细胞输注；HAA：高三尖杉酯碱+阿克拉霉素+阿糖胞苷；IA：去甲氧柔红霉素+阿糖胞苷
2．预处理方案：全部采用常规的改良BU/CY（白消安/环磷酰胺）方案，HLA配型不合移植预处理中加用抗胸腺细胞球蛋白（ATG）。
3．干细胞的动员和采集：全部患者采用骨髓联合外周血干细胞移植，所有患者均以G-CSF进行干细胞动员。
4．急性GVHD的预防：采用环孢素A（CsA）+霉酚酸酯（MMF）+短程甲氨蝶呤（MTX）方案。
5．植活标准：中性粒细胞绝对计数（ANC）≥0.5×109/L连续3 d为粒细胞植活，PLT≥20×109/L连续7 d且脱离血小板输注为血小板植活。
6．移植后微小残留病（MRD）监测：对于伴重现性染色体异常的急性白血病患者，以其特征性标志基因作为监测指标，高于0.4%定义为阳性[10]；对于没有特征性标志基因的急性白血病患者，我们采用WT1基因作为监测指标，≥0.6%定义为阳性[11]。采用流式细胞术检测白血病相关免疫表型（LAIP）。移植后1、2、3、4.5、6、9、12个月检测MRD，基因检测或LAIP阳性者2周后复查。MRD阳性（分子生物学复发）定义如下：①连续2次出现特异性基因或LAIP阳性；②同时检出特异性基因和LAIP阳性。血液学复发定义为骨髓中原始细胞大于5%。
入组标准：对于复发患者（血液学复发/分子生物学复发），给予改良DLI[12]，改良DLI疗效不满意的患者给予地西他滨治疗。改良DLI和地西他滨治疗后继续监测MRD。所有接受治疗的患者均签署知情同意书。
7．改良DLI疗效判定：①完全有效（CR）：治疗后1个月特异性基因或WT1转阴，且在随访过程中未再转阳；②部分有效：治疗后1个月特异性基因或WT1下降≥1个log，且在随访过程中上升<1个log；③稳定：治疗后特异性基因下降≤1个log，但在随访过程中无进一步下降；WT1治疗后1个月没有上升，且较前有所下降，但在随访过程中未能转阴；④无效：治疗后1个月基因进一步上升；⑤失去疗效：特异性基因或WT1：曾经达到完全有效，但在随访过程中再次从阴性转成阳性。
将稳定、无效和失去疗效定义为DLI疗效不满意，可以考虑给予地西他滨干预。
8．治疗方案：患者的预处理、GVHD预防、移植复发后化疗和改良DLI的方案按照我所常规方案[10],[13]–[14]进行。在改良DLI治疗后，对于疗效稳定的患者可以根据患者意愿，选择观察3~6个月，若仍判断改良DLI疗效为稳定可尝试停用免疫抑制剂，同时给予小剂量IL-2治疗（1×106 U·kg−1·d−1，连续2周为1个疗程）；若停用免疫抑制剂后1~2个月判断疗效仍为稳定、无效或失去疗效则给予干扰素α或小剂量地西他滨治疗；对于改良DLI无效或失去疗效的患者直接给予地西他滨治疗，同时停用免疫抑制剂。地西他滨选用20 mg·m−2·d−1（2例）或15 mg·m−2·d−1（2例），连续应用5 d。
9．标本采集：地西他滨治疗前、采集外周血标本；治疗后5周内，每周采集1次外周血标本。采用8色流式细胞术分别检测CD4+CD25−CD127+效应性T细胞（Tcon细胞）、CD4+CD25highCD127low、CD4+Treg细胞、CD3+CD8−IFN−γ+T细胞（Th1细胞）、CD3+CD8−IL17a+T细胞（Th17细胞）、CD8+CD25+FoxP3+ Treg细胞（CD8+ Treg细胞）、CD3+CD8+IFN-γ+T细胞（Tc1细胞）、CD3+CD8+IL17+ T细胞（Tc17细胞）表达，同时检测NK细胞IFN-γ分泌水平以及杀伤活性。
10．流式细胞术检测：①第1管（膜表面抗体标记）：采用8色抗体组合，CD62L-FITC、CD56-PE、CD4-Percp、CD69-APC、CD3-V500（美国Becton Dickinson公司产品）、CD16-APC/CY7、CD25-PE/CY7、CD127-Brilliant Violet（美国BioLegend公司产品）；②第2管（FoxP3及胞内细胞因子IL-17a、IFN-γ检测）：免疫荧光抗体包括CD3-APC/CY7、CD25-PE/CY7、CD8-Eflour 660（美国ebioscience公司产品）；按照Cytofix/Cytoperm试剂盒（美国ebioscience公司产品）说明操作固定破膜后，标记胞质内FoxP3-Eflour 450、ROR-γ-PE、IFN-γ-Percp和IL-17a-FITC的表达（美国ebioscience公司产品）；③第3管CD107a及IFN-γ检测：具体方法检测按我所之前研究[15]。所用细胞膜表面免疫荧光包括：CD3-多甲藻黄素叶绿素蛋白质复合物（PerCP），CD107a-PE，CD158a-异硫氰酸荧光素（FITC），CD158b-FITC，CD158e-FITC（美国Becton Dickinson公司产品）及CD56-APC/cy7，CD57-太平洋蓝（美国Biolengend公司产品）；所用细胞内免疫荧光抗体为IFN-γ-PE-CY7。固定破膜采用Cytofix/Cytoperm试剂盒（美国Becton Dickinson公司产品）。